تشخیص و کلون نمودن پروموتر ژن pep موشی

چکیده پروتئین پراکسیزوی (pep)، یکی از پروتئین های ماتریکس پراکسیزومی است که بوسیله ژن fndc5 کد می شود، که در موش شامل 6 اگزون است و روی کروموزوم 4 قرار دارد. cdna آن توسط ferrer martinez و همکارانش کلون شد. این پروتئین همولوژی ای با دیگر پروتئین ها ندارد، هرچند در زیرواحدهای اسید آمینه های114 -31 حاوی یک دامنه فیبرونکتین تایپ iii می باشد. هنوز هیچ نقش خاصِ برای این پروتئین شناخته نشده است. مشخص شده است که بیان ژن pep موشی تحت تأثیر رتینوئیک اسید روی سلول های بنیادی طی پروسه نوروژنز افزایش می یابد. پس، تعیین ویژگی پروموتر pep می تواند سناریویی که پشت این رویداد وجود دارد مشخص نماید. بنابراین، هدف این پژوهش کلون نمودن ناحیه پروموتر فرضی pep بود. در مرحله اول، مطالعات بیوانفورماتیکی برای یافتن پروموتر فرضی برای پروموتر pep انجام شد. مطالعات بیوانفورماتیکی، با استفاده از نرم افزارهای معمول برای پیش بینی پروموتر، یک ناحیه ی پروموتر فرضی در موقعیت 101+/ 561- نسبت به جایگاه آغاز رونویسی ژن pep مشخص شد. آنالیز بیشتر با چندین نرم افزار عناصر مختلفی را در این ناحیه را، از قبیل موتیف vdrrxr در موقعیت 14+/11- و موتیف tfiib در موقعیت 64+/59+ . تشخیص داد. cpg island finder و gc plot analysis نشان داد که این ناحیه 70.01% gc rich است و یک cpg island بعنوان شاخص پروموتری دارد. پس، پرایمرهای اختصاصی با قرار دادن دو جایگاه تشخیصی، nhei وasei ، بترتیب درانتهاهای بالا وپایین محصول، طراحی شد. به دلیل ویژگی gc rich این ناحیه، برای بهینه کردن شرایط pcr، افزودنی ها مورد استفاده قرار گرفت. ترکیب شرایط pcr تنظیم شده شامل بتائین (1m)، dmso (10%) و غلظت بالایی لز کلرید منیزیوم (4mm) در حضور بافر ams ، برای تکثیر این ناحیه مورد استفاده قرار گرفت قطعات تکثیر شده شامل (1) اگزون 1 و قسمتی از اینترون i (ساختار a) (2) اگزون 1 که بصورت frame با ژن گزارشگز egfp است (ساختار b) و (3) قطعه جهش یافته در جایگاه آغاز رونویسی (ساختار c) تکثیر بهینه شده این نواحی بطور موفقیت آمیزی برای کلون نمودن بعدی این قطعات dna درون وکتور ptz. سپس ساب کلون درون وکتور بیانی یوکاریوتی مناسب pdb2 بالادست ژن گزارشگر egfp برای ارزیابی بیشتر این ناحیه بعد از ترانسفکت نمودن درون سلول های cho، p19 و سلول های بنیادی موشی (mescs) انجام شد. برای ساخت یک وکتور pdb2 بدون پروموتر، هضم آنزیمی انجام شد. فعالیت پروموتری در سلول های cho با استفاده از آنالیز فلوسایتومتری ارزیابی شد. داده ها نشان داد که قطعه تکثیر شده هنگامیکه در سلول های cho ارزیابی شد عملکرد پروموتری را دارد و فعالیتی 12 برابر ضعیف تر از پروموتر cmv را نشان داد. در میان ساختارهای مختلف، ساختار c فعالیت پروموتری بیشتری را نشان داد و برای ترانسفکت درون p19 و mesc انتخاب شد. فعالیت پروموتری با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت اسکن شد. به دلیل بیان کم pep در این دودمان های سلولی، دودمان سلولی پایدار برای ساختار c تهیه شد. نوروژنز در این دودمان سلولی پایدار تحت تأثیر رتینوئیک اسید، ویتامین d و noggin انجام شد. بیان pep اندوژنز و گزارشگر egfp با استفاده از ra و noggin در روز 6 و 14 افزایش یافت. اما بعد از مواجهه با ویتامین ِ کاهش داشت. noggin بعنوان یک فاکتور مورد نیاز برای نوروژنز مستقل از رتینوئیک اسید استفاده شد. مواجهه با noggin بیان ژن pep را در روز 14 بطورچشمگیری افزایش داد که نشان داد که افزایش بیان ژن pep 6 روز اول نوروژنز تحت تأثیر رتینوئیک اسید بطور چشمگیری اتفاق میافتد و افزایش بیان ژن pep از مرحله تشکیل precursor cellتا neurosphere تحت تأثیر روند عصب زایی است.